摘要：研究銀耳多糖的提取分離與純化

關(guān)鍵詞：銀耳多糖；純化

銀耳多糖是從銀耳子實體或液體深層發(fā)酵的銀耳孢子中提取出來的一種活性多糖，從椴木銀耳中提取分離得到的酸性銀耳多糖具有廣泛的藥理活性,具有提高機體免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗?jié)?、抗血栓形成、等作?/span>^[1]，能增強機體耐缺氧能力，清除自由基，能使人體產(chǎn)生抗體及干擾素。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料 椴木銀耳

1.2 試劑

2%的氫氧化鈉:10g氫氧化鈉加少量水溶解,定容至500mL,轉(zhuǎn)入試劑瓶保存?zhèn)溆?1%活性碳;稱取重蒸苯酚50g,定容至1000mg·mL- 1,配成5%的苯酚溶液,避光低溫保存待用;標準葡萄糖溶液(0.1mg·mL- 1):100mg標準葡萄糖定容至1000mL;硫酸,乙醇,丙酮,乙醚:均為AR級;DEAE-C52;Sevage試劑:氯仿-正丁醇溶液;0.5mol·L- 1鹽酸:41.5mL鹽酸加水稀釋到1000mL,試劑瓶保存?zhèn)溆?2mol·L- 1 NaCl溶液500mL。

1.3 儀器

雙重蒸餾水蒸餾器，超級恒溫水浴，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE52型，紫外可見分光光度計752N，低速大容量多管離心機LXJ-ⅡB型，透析袋，鋁鍋，攪拌器，天平，精密電子天平,電爐等。

2 實驗方法

2.1 銀耳多糖的提取

將20g銀耳子實體和800mL水加入1000mL燒杯中，于沸水浴中加熱攪拌8h，離心去殘渣(3000r/min,25min)。上清液用硅藻土助濾，水洗，合并濾液后于80℃水浴攪拌濃縮至糖漿狀。用2mol·L-1NaOH調(diào)至pH 7，加熱回流，用1%活性炭脫色,抽濾,濾液扎袋,流水透析48h。透析液離心(3000r·min-1,10min),上清液于80℃水浴濃縮至原體積的1/3。然后加入3倍量95%乙醇,攪拌均勻后,離心(3000r·min-1,15min),沉淀用無水乙醇洗滌2次,乙醚洗滌一次,真空干燥得銀耳多糖粗品。提取銀耳多糖的工藝流程(見圖1)。

2.2 銀耳粗多糖的純化

2.2.1 多糖液脫蛋白：

將粗多糖樣品溶于一定量的蒸餾水中，加入2/3體積的Sevage試劑(氯仿∶正丁醇= 5∶1，v/v)，然后將其置于分液漏斗中充分振搖10min，靜置分層。分液除去蛋白質(zhì)沉淀后繼續(xù)加入Sevage試劑，重復3次。粗糖液蒸發(fā)濃縮，真空干燥得以進一步提純的粗多糖樣品，供季銨鹽法(CTAB)沉淀用。

2.2.2 季胺鹽沉淀法提純粗多糖：

0.5g銀耳粗多糖溶于50mL水中，溶解后離心(3000r·min- 1，10min)去除相應的沉淀,上清液加2%CTAB溶液至沉淀完全，搖勻，靜置4h,離心，沉淀用熱水洗滌3次，加100mL 2mol·L- 1 NaCl溶液于60℃解離4h,離心(3000r·min-1，10min),上清液流水透析12h。透析液于80℃水浴濃縮，加三倍量95%乙醇，攪拌均勻后，離心(3000r·min-1,10min)，沉淀再分別用無水乙醇、乙醚洗滌，真空干燥，得精品銀耳多糖，測定多糖含量。

2.3 多糖含量測定

硫酸苯酚比色法測定糖含量：其原理是，糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10mg～ 100mg范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490nm波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測定。此比色法方法簡單，靈敏度高，實驗時基本不受蛋白質(zhì)存在的影響,并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160min以上。

2.3.1 制備標準曲線：取5支潔凈的糖管，按表1操作。

表1： 糖含量測定操作表

2.3.2 樣品糖含量測定：配制0.1mol·L的樣品液（粗品和精品），分別取1ml于試管中，其他操作同上。

3 實驗結(jié)果

3.1 銀耳多糖的產(chǎn)量與產(chǎn)率（見表2）

表2 銀耳多糖純化前后產(chǎn)量與產(chǎn)率

3.2 多糖含量測定的標準曲線（見圖2、表3）

圖二：標準曲線

表3：多糖含量測定實驗數(shù)據(jù)

3.3 樣品糖含量測定：樣品中粗品A=0.478，精品A=0.614.由回歸線方程A=1.1145C+0.0298得到粗品含糖0.495/0.1=50.5%；精品含量76.28%。

4 討論

本實驗采用的是季銨鹽（CTAB）沉淀法提取粗多糖，其原理為：

長鏈季胺鹽能與酸性多糖成鹽形成水不溶性化合物,可分離酸性及中性多糖。常用的季胺鹽是十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑,具有從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性,但其在高離子強度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復合物,卻不能沉淀核酸,所以我們在提取銀耳多糖后先用Sevage試劑[2]去除溶液中蛋白質(zhì),再通過加入CTAB沉淀銀耳多糖，最后加入乙醇沉淀即可使多糖分離出來。一般地說,酸性強或分子量大的酸性多糖首先沉淀出來。

季銨鹽沉淀法純化效果較好，既經(jīng)濟又具有實用性，很適宜工業(yè)生產(chǎn)。在提取過程中可適當加熱，溫度不宜高過60℃，且需要不斷的攪拌以使提取能夠充分。經(jīng)檢測，粗品經(jīng)過CTAB法純化產(chǎn)率在37.4%，粗品中含糖50.5%。純化之后繼續(xù)檢測得到的產(chǎn)品，結(jié)果顯示產(chǎn)品含糖最高達76.28%。

文獻

[1] 聶偉,張永祥,周金黃.銀耳多糖的藥理學研究概況[J]，中藥藥理與臨床.2000,16(4):44- 46.

[2] evag MG:Biochen Z:273:419.1994.

[3] 和偉珍,吳麗仙.銀耳多糖的提取分離與純化[J]，海峽藥學.2008,20(7):33-35.